{"id":20747,"date":"2021-03-23T15:44:21","date_gmt":"2021-03-23T15:44:21","guid":{"rendered":"http:\/\/prrscontrolidiomas.advertis.es\/5-deteccion-del-virus\/"},"modified":"2021-03-26T12:08:48","modified_gmt":"2021-03-26T12:08:48","slug":"deteccion-del-virus","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/prrscontrol.com\/es\/diagnostico-y-monitorizacion\/deteccion-del-virus\/","title":{"rendered":"5<\/span> Detecci\u00f3n del virus"},"content":{"rendered":"

[vc_row][vc_column width=\u00bb1\/1″][vc_column_text el_class=\u00bbintro\u00bb]La identificaci\u00f3n del virus se puede lograr mediante la detecci\u00f3n de prote\u00ednas virales\u00a0(ant\u00edgeno) o de \u00e1cidos nucleicos y mediante el aislamiento.[\/vc_column_text][vc_column_text]<\/p>\n

Inmunohistoqu\u00edmica (IHQ) e hibridaci\u00f3n in situ (HIS).<\/h2>\n

El ant\u00edgeno y el \u00e1cido nucleico<\/strong> del virus del PRRS pueden detectarse en tejidos mediante\u00a0IHQ o HIS<\/strong>, respectivamente. La relaci\u00f3n entre la presencia del virus y las lesiones puede\u00a0establecerse mediante una combinaci\u00f3n de IHQ o HIS e histopatolog\u00eda.[\/vc_column_text]

\"\"<\/a><\/div>[vc_column_text el_class=\u00bbdestacado\u00bb][\/vc_column_text][vc_column_text]<\/p>\n

Aislamiento y titulaci\u00f3n del virus<\/h2>\n

Mientras que las cepas de PRRSV2 pueden aislarse tanto en cultivos de macr\u00f3fagos alveolares\u00a0porcinos como en subl\u00edneas de la l\u00ednea celular de ri\u00f1\u00f3n de mono africano (CL-2621 y MARC-145), muchos de los virus PRRSV1 o parecidos a los europeos se pueden aislar \u00fanicamente en\u00a0macr\u00f3fagos alveolares porcinos.<\/p>\n

Dado que los efectos citop\u00e1ticos, que ocurren en 1-4 d\u00edas, no siempre son claros, la replicaci\u00f3n\u00a0del virus en los cultivos celulares generalmente debe confirmarse mediante RT-PCR, IPMA o\u00a0IF<\/strong> (sensibilidad m\u00e1xima a los 7 d\u00edas). La titulaci\u00f3n del virus se puede hacer usando diluciones\u00a0en serie de la muestra.<\/p>\n

[\/vc_column_text]

\"\"<\/a><\/div>[vc_column_text][\/vc_column_text][vc_column_text]<\/p>\n

Detecci\u00f3n del genoma del virus<\/h2>\n

[\/vc_column_text][vc_column_text]<\/p>\n

Fragmentos de restricci\u00f3n de longitud polim\u00f3rfica (Restriction Fragment Length\u00a0Polymorphism; RFLP)<\/h3>\n

Implica la digesti\u00f3n de la ORF5 por tres enzimas de restricci\u00f3n. Como resultado, se genera\u00a0un patr\u00f3n de tres d\u00edgitos. Esta t\u00e9cnica se utiliza para diferenciar aislados<\/strong>. Sin embargo, se ha\u00a0demostrado que diferentes aislados pueden compartir patrones de RFLP similares.<\/p>\n

Por lo tanto,\u00a0para diferenciar aislados la secuenciaci\u00f3n (ver a continuaci\u00f3n) es mejor que la t\u00e9cnica RFLP.[\/vc_column_text][vc_column_text]<\/p>\n

La reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa con transcripci\u00f3n inversa (RT-PCR)<\/h3>\n

RT-PCR, junto al ELISA, es la prueba diagn\u00f3stica m\u00e1s com\u00fanmente utilizada para PRRS.\u00a0Se basa en la detecci\u00f3n y la amplificaci\u00f3n de un segmento espec\u00edfico del genoma<\/strong>. Es m\u00e1s\u00a0sensible que el aislamiento del virus, pero como detecta el genoma, un resultado positivo no\u00a0implica necesariamente la presencia de virus viable.<\/p>\n

La RT-PCR se usa generalmente para amplificar regiones de la ORF5 y de la ORF7. Su\u00a0sensibilidad es variable debido a la diversidad gen\u00e9tica del virus. Puesto que la diversidad\u00a0aumenta de forma constante, se requiere una actualizaci\u00f3n continua de los cebadores\u00a0utilizados con el objeto de minimizar los resultados falsos negativos.[\/vc_column_text][vc_column_text][\/vc_column_text]

\"\"<\/a><\/div>[vc_column_text][\/vc_column_text][vc_column_text]Se basa en la detecci\u00f3n, la amplificaci\u00f3n y la cuantificaci\u00f3n de un segmento espec\u00edfico del\u00a0genoma. Detecta y mide la amplificaci\u00f3n de un segmento concreto durante cada ciclo de\u00a0una reacci\u00f3n de PCR a tiempo real, y no al final, como ocurre en la RT-PCR convencional.<\/p>\n

De forma breve, los oligonucle\u00f3tidos marcados con un indicador fluorescente permiten la\u00a0detecci\u00f3n despu\u00e9s de la hibridaci\u00f3n de la sonda con su secuencia complementaria.<\/p>\n

Mediante\u00a0el instrumento de RT-PCR en tiempo real, se realiza la medici\u00f3n de la acumulaci\u00f3n de la se\u00f1al\u00a0fluorescente. Se puede realizar una cuantificaci\u00f3n relativa (semi-cuantificaci\u00f3n) o absoluta\u00a0del segmento objetivo.<\/p>\n

Para realizar una cuantificaci\u00f3n exacta, se requiere crear una l\u00ednea\u00a0est\u00e1ndar a partir de diluciones en serie de la misma cepa que intentamos detectar.[\/vc_column_text][vc_column_text]<\/p>\n

Tiempo real RT-PCR<\/h3>\n

Los resultados RT-PCR a tiempo real generalmente se muestran como valores de Ct. El valor\u00a0de Ct es inverso a la cantidad de \u00e1cido nucleico que est\u00e1 presente en la muestra<\/strong>.<\/p>\n

Puede\u00a0estar exactamente (cuantificaci\u00f3n absoluta) o aproximadamente (semicuantificaci\u00f3n)\u00a0correlacionado con el n\u00famero de copias del virus presente en la muestra. Por lo tanto, los\u00a0valores m\u00e1s bajos de Ct indican cantidades altas, mientras que los valores m\u00e1s altos de Ct\u00a0significan cantidades bajas de \u00e1cido nucleico. Para las infecciones por el virus del PRRS,\u00a0los valores t\u00edpicos de Ct est\u00e1n alrededor de 26 ciclos, con una variabilidad significativa\u00a0dependiendo de la edad del animal; los valores de Ct alrededor de 17-18 ciclos se pueden\u00a0encontrar en algunos lechones vir\u00e9micos reci\u00e9n nacidos, mientras que los valores m\u00e1s altos\u00a0de Ct (alrededor de 26) se pueden encontrar en adultos.<\/p>\n

En general, los valores de Ct \u2265 37\u00a0ciclos se consideran resultados con una importancia biol\u00f3gica relativamente baja o nula.<\/p>\n

Las\u00a0viremias debidas a las vacunaciones con virus atenuados suelen oscilar entre 30 y 35, seg\u00fan\u00a0la cepa y la edad del animal. Todos estos valores deben ser tomados \u00fanicamente como una\u00a0mera aproximaci\u00f3n.<\/p>\n

En la actualidad, hay disponibles ensayos comerciales de RT-PCR a tiempo real, pero aun\u00a0en algunos laboratorios es un ensayo home-made. En estos \u00faltimos casos pueden existir\u00a0discrepancias en los resultados entre laboratorios, ya que difieren en el dise\u00f1o de cebadores,\u00a0sondas\u2026<\/p>\n

De manera similar a la RT-PCR convencional, podr\u00eda existir un n\u00famero variable de\u00a0falsos negativos. Por lo general, depende de la estandarizaci\u00f3n, mejora y actualizaci\u00f3n del\u00a0ensayo y de la experiencia del laboratorio.<\/p>\n

De todas formas, la sensibilidad de la RT-PCR a\u00a0tiempo real es similar o ligeramente superior a la de la RT-PCR convencional, pero nuevamente\u00a0se basa en la idoneidad de los cebadores con la secuencia de la muestra problema.\u00a0Obviamente, la RT-PCR a tiempo real puede dise\u00f1arse para distinguir entre especies.[\/vc_column_text]

\"\"<\/a><\/div>[vc_column_text el_class=\u00bbaviso\u00bb]<\/p>\n
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<\/i>Referencias<\/div>

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