{"id":20753,"date":"2021-03-23T15:59:33","date_gmt":"2021-03-23T15:59:33","guid":{"rendered":"http:\/\/prrscontrolidiomas.advertis.es\/6-secuenciacion\/"},"modified":"2021-03-26T12:14:18","modified_gmt":"2021-03-26T12:14:18","slug":"secuenciacion","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/prrscontrol.com\/es\/diagnostico-y-monitorizacion\/secuenciacion\/","title":{"rendered":"6<\/span> Secuenciaci\u00f3n"},"content":{"rendered":"

[vc_row][vc_column width=\u00bb1\/1″][vc_column_text el_class=\u00bbintro\u00bb]El ADN obtenido durante el ensayo de RT-PCR se puede secuenciar y por tanto podemos\u00a0obtener el orden de los nucle\u00f3tidos en el genoma<\/strong>. La secuenciaci\u00f3n del ADN es \u00fatil para\u00a0discriminar entre cepas individuales<\/strong>. Normalmente, la relaci\u00f3n entre los diferentes\u00a0aislados se ha realizado en base a la comparaci\u00f3n de las secuencias de ORF5, ORF6 u ORF7<\/strong>.[\/vc_column_text][vc_column_text]Con respecto a las muestras de sangre individuales, es importante tener en cuenta\u00a0que para secuenciar se necesitan muestras con valores de Ct por debajo de 32. Las\u00a0muestras con valores de Ct> 32 son dif\u00edciles de secuenciar<\/strong>, ya que la cantidad de virus\u00a0es insuficiente.<\/p>\n

Los fluidos orales grupales y los pooles de sangre no deben usarse para\u00a0secuenciar, ya que al mezclar diferentes animales estamos disminuyendo la cantidad de\u00a0virus presente y adem\u00e1s pueden contener f\u00e1cilmente m\u00e1s de una cepa.[\/vc_column_text][vc_column_text el_class=\u00bbdestacado\u00bb]<\/p>\n

La secuenciaci\u00f3n es una herramienta de diagn\u00f3stico\u00a0complementaria. Es \u00fatil para poder tomar decisiones en\u00a0relaci\u00f3n a las medidas de control del virus.<\/strong><\/p><\/blockquote>\n

[\/vc_column_text]

\"\"<\/a><\/div>[vc_column_text][\/vc_column_text][vc_column_text]<\/p>\n

Mediante la secuenciaci\u00f3n es posible:<\/h2>\n
    \n
  1. Distinguir especies<\/li>\n
  2. Distinguir aislados de virus de campo de las vacunas<\/li>\n
  3. Obtener una valiosa informaci\u00f3n epidemiol\u00f3gica para determinar la fuente de la\u00a0infecci\u00f3n, cu\u00e1ntas cepas est\u00e1n presentes en un hato\/granja\/poblaci\u00f3n\/empresa\/regi\u00f3n, cu\u00e1l es el m\u00e1s frecuente, los eventos de recombinaci\u00f3n, etc.<\/li>\n<\/ol>\n

    [\/vc_column_text][vc_column_text]En general, si se obtienen secuencias con cierta frecuencia (se recomienda secuenciar cada\u00a0cepa involucrada en un brote o peri\u00f3dicamente, al menos cada seis meses<\/strong>), podemos llegar\u00a0a determinar la fuente principal de infecciones y c\u00f3mo circulan los aislados en un hato o\u00a0en una regi\u00f3n.<\/p>\n

    Eventualmente, podr\u00edamos usar esta informaci\u00f3n para establecer mejores\u00a0medidas de control de la enfermedad.[\/vc_column_text][vc_column_text]<\/p>\n

    Hoy en d\u00eda, a trav\u00e9s de la secuenciaci\u00f3n no es posible:<\/h2>\n
      \n
    1. (En general) predecir la virulencia de un aislamiento determinado;<\/li>\n
    2. Predecir el nivel de protecci\u00f3n cruzada entre dos aislados, ya que los marcadores\u00a0gen\u00e9ticos de virulencia y protecci\u00f3n cruzada no se conocen con exactitud.<\/li>\n<\/ol>\n

      [\/vc_column_text][vc_column_text el_class=\u00bbdestacado\u00bb]<\/p>\n

      La secuencia no debe usarse para decidir qu\u00e9 vacuna debe usarse\u00a0frente a un aislado concreto, ya que se ha demostrado que el nivel\u00a0de protecci\u00f3n cruzada que pueda existir entre dos cepas no est\u00e1\u00a0relacionado con el nivel general de homolog\u00eda (relaci\u00f3n gen\u00e9tica).<\/strong><\/p><\/blockquote>\n

      [\/vc_column_text][vc_column_text]Para poder comparar el grado de similitud entre aislados y agruparlos seg\u00fan sus\u00a0secuencias, se puede dibujar un \u00e1rbol filogen\u00e9tico<\/strong>.<\/p>\n

      En general, para ilustrar las\u00a0relaciones entre varios aislados los \u00e1rboles son m\u00e1s \u00fatiles que la simple comparaci\u00f3n\u00a0de porcentajes de homolog\u00eda, ya que puede suceder que un grupo de cepas compartan\u00a0un mismo porcentaje de similitud aun siendo diferentes.<\/p>\n

      En estos casos, los \u00e1rboles son\u00a0cruciales para observar las relaciones reales.[\/vc_column_text]

      \"\"<\/a><\/div>[vc_column_text][\/vc_column_text][vc_column_text]\u00c1rbol filogen\u00e9tico obtenido mediante el an\u00e1lisis de siete secuencias ORF5 de cuatro or\u00edgenes diferentes.<\/p>\n

      La barra\u00a0representa una sustituci\u00f3n de 0,1 nucle\u00f3tidos por sitio.\u00a0La interpretaci\u00f3n de este \u00e1rbol es la siguiente: en la rama inferior\u00a0hay un aislado no relacionado del origen 1 (O1) (O1- I3); su similitud con O1-I1 y O1-I2 del mismo origen, ubicados en la\u00a0rama superior del \u00e1rbol, es de 93,4% y 93,2%, respectivamente.<\/p>\n

      La similitud entre estos dos aislados relacionadas (O1-I1 y O1-I2) es del 97.5%. En el origen 2, hay dos aislados no relacionados: I4 e I5 (la similitud entre ellos es del 96,6%).<\/p>\n

      Probablemente, existe un v\u00ednculo entre los aislados O2-I4 y el origen 1 y entre O2-I5 y el origen 3. Finalmente, los aislados
      \nI6 e I7 del origen 3 est\u00e1n estrechamente relacionados (> 99,8%; seguramente son la misma cepa).[\/vc_column_text][vc_column_text el_class=\u00bbdestacado\u00bb]<\/p>\n

      Com\u00fanmente se acepta que dos aislados son diferentes si la similitud entre ellos es inferior\u00a0al 97% (ORF5).<\/strong><\/p><\/blockquote>\n

      [\/vc_column_text][vc_column_text]Sin embargo, este punto de corte es completamente arbitrario. Para evitar\u00a0interpretaciones err\u00f3neas, se debe tener en cuenta informaci\u00f3n adicional, tales como fechas\u00a0y lugares de aislamiento, las relaciones epidemiol\u00f3gicas que se establecen entre las granjas y\u00a0or\u00edgenes implicados.<\/p>\n

      Los eventos de recombinaci\u00f3n deben considerarse cuando se calculan los \u00e1rboles filogen\u00e9ticos,\u00a0ya que pueden desdibujar las verdaderas relaciones filogen\u00e9ticas entre cepas.[\/vc_column_text]

      \"\"<\/a><\/div>[vc_column_text][\/vc_column_text][vc_column_text]<\/p>\n

      Secuenciaci\u00f3n Sanger<\/h2>\n

      Hasta hace poco, la secuenciaci\u00f3n de Sanger ha sido la principal herramienta para estudiar\u00a0la diversidad gen\u00e9tica. Sin embargo, esta t\u00e9cnica tiene varias limitaciones. Una de las m\u00e1s\u00a0importantes es que solo podemos obtener la secuencia de consenso.<\/p>\n

      Como se ha dicho en\u00a0repetidas ocasiones, el virus del PRRS existe en el hospedador como cuasiespecie. Por lo tanto,\u00a0los mutantes de baja frecuencia se obvian cuando se usa Sanger.<\/p>\n

      Adem\u00e1s, las secuencias\u00a0obtenidas mediante la t\u00e9cnica de Sanger son muy dif\u00edciles de interpretar si en la muestra hay\u00a0presentes dos o m\u00e1s cepas.[\/vc_column_text][vc_column_text]Aunque representa una proporci\u00f3n muy limitada del genoma total (4%), la ORF5 se usa\u00a0generalmente para comparar cepas<\/strong>. Esto es as\u00ed porque esta ORF tiene una alta tasa de\u00a0mutaci\u00f3n y los cambios son f\u00e1ciles de observar.<\/p>\n

      Obviamente, la secuenciaci\u00f3n del genoma\u00a0completo proporcionar\u00eda mucha m\u00e1s informaci\u00f3n:<\/p>\n

        \n
      1. Agrupaciones filogen\u00e9ticas y comparaciones entre cepas con mayor precisi\u00f3n<\/li>\n
      2. Identificaci\u00f3n de posibles ep\u00edtopos, marcadores epidemiol\u00f3gicos o de virulencia<\/li>\n
      3. Identificaci\u00f3n de eventos de recombinaci\u00f3n m\u00e1s all\u00e1 de la ORF5.<\/li>\n<\/ol>\n

        Sin embargo, la secuenciaci\u00f3n del genoma completo mediante Sanger es una tarea que\u00a0requiere mucho tiempo, ya que precisa de la secuenciaci\u00f3n de muchos segmentos de genoma\u00a0superpuestos y consecutivos amplificados previamente por PCR.<\/p>\n

        En consecuencia, en comparaci\u00f3n con ORF5 u ORF7, hay pocas secuencias de genoma\u00a0completo disponibles.[\/vc_column_text][vc_column_text]<\/p>\n

        Secuenciaci\u00f3n masiva<\/h2>\n

        Varias de las limitaciones que hemos discutido sobre secuenciaci\u00f3n Sanger pueden superarse\u00a0utilizando la secuenciaci\u00f3n masiva o de pr\u00f3xima generaci\u00f3n (NGS, por su acr\u00f3nimo en ingl\u00e9s).\u00a0El t\u00e9rmino se utiliza para describir una serie de diferentes tecnolog\u00edas de secuenciaci\u00f3n\u00a0no basadas en Sanger.<\/p>\n

        Estas tecnolog\u00edas tienen un enorme potencial y ciertamente son\u00a0una revoluci\u00f3n en el campo de la gen\u00f3mica y la biolog\u00eda molecular, ya que nos permiten\u00a0secuenciar el ADN y el ARN mucho m\u00e1s r\u00e1pido y de forma extremadamente m\u00e1s profunda que\u00a0la secuenciaci\u00f3n Sanger.[\/vc_column_text][vc_column_text]<\/p>\n

        Ventajas de la NGS:<\/h3>\n