Что касается отдельных образцов крови, важно отметить, что для секвенирования необходимы значения Ct ниже 32; образцы с Ct значения > 32 трудно секвенировать Поскольку количество вируса недостаточно, следует избегать пероральных жидкостей и пулов сывороток для секвенирования, поскольку они могут легко содержать более одного штамма, и поскольку путем смешивания различных образцов мы уменьшаем количество вируса.

С помощью секвенирования можно:

1. Различают виды
2. Отличие полевых вирусов от вакцин
3. Получить ценную эпидемиологическую информацию, полезную для определения источника инфекции, сколько штаммов присутствует в стаде/ферме/популяции, что является наиболее распространенным, рекомбинационными событиями и т.д.

В общем случае, если последовательности часто контролируются (это рекомендуется от каждого штамма, вовлеченного в каждую вспышку или периодически), не реже одного раза в шесть месяцевМы можем определить основной источник инфекций и то, как изоляты циркулируют в одном стаде или в регионе. В конце концов, мы могли бы использовать эту информацию для установления более эффективных мер по контролю PRRS.

С помощью секвенирования невозможно:

1. Предсказывает вирулентность данного изолята в целом.
2. Предсказать уровень перекрестной защиты между двумя изолятами, поскольку генетические маркеры вирулентности и перекрестной защиты не были должным образом идентифицированы.

Для того чтобы сравнить степень сходства между изолятами и сгруппировать их по их последовательностям, филогенетическое дерево Деревья более полезны для иллюстрации отношений между различными изолятами, чем просто сравнение процентных долей гомологии. Может случиться так, что группа штаммов может иметь один и тот же процент сходства, даже будучи разными среди них; в этих случаях деревья имеют решающее значение для наблюдения за реальными отношениями.

На изображении выше представлено филогенетическое дерево, полученное при анализе семи последовательностей ORF5 из четырех разных мест происхождения. Бар представляет собой 0,1 нуклеотидную замену на участок. Интерпретация этого дерева такова: в нижней ветви присутствует один несвязанный штамм из источника 1 (O1) (аналогичность O1-I1 и O1-I2 из одного и того же происхождения, расположенная в верхней ветви дерева 93,4% и 93,2% соответственно). Сходство между этими двумя родственными штаммами (O1-I1 и O1-I2) составляет 97,5%. В происхождении 2 также присутствуют два несвязанных штамма I4 и I5 (аналогичность между ними составляет 96,6%). Вероятно, существует связь между O2-I4 и происхождением 1 и между O2-I5 и происхождением 3. Наконец, штаммы I6 и I7 из происхождения 3 тесно связаны (см.>99,8% идентичны.

Однако эта точка отсечения совершенно произвольна. Во избежание неверных толкований следует учитывать дополнительную информацию, такую как даты и места выделений, а также отношения между фермами или происхождением. Стоит отметить, что рекомбинацию следует учитывать при вычислении филогенетических деревьев, поскольку она является признаком эволюции РНК-вируса и может размыть истинные филогенетические отношения между штаммами.

Секвенирование Сэнгера

До недавнего времени секвенирование Сэнгера было основным инструментом изучения генетического разнообразия. Однако, хотя полезная эта методика имеет несколько ограничений; она только извлекает консенсусные последовательности, наиболее распространенный вариант, присутствующий в образце. Как неоднократно заявлялось, вирус PRRS существует в хозяине как квазивид. Поэтому низкочастотные мутанты игнорируются при использовании Сэнгера. Более того, при наличии двух или более различных штаммов последовательности, полученные техникой Сэнгера, очень трудно интерпретировать.

Хотя он представляет очень ограниченную долю общего генома (4%), ORF5 обычно используется для сравнения штаммов.Поскольку он имеет высокую скорость мутации и изменения легче наблюдать. Очевидно, что секвенирование всего генома даст гораздо больше информации:

1. Более точно филогенетическая группировка и сравнения между штаммами.
2. Выявление потенциальных эпитопов, эпидемиологических или вирулентных маркеров.
3. Идентификация событий рекомбинации за пределами ORF5 или ORF7.

Однако секвенирование всего генома Сэнгера является очень трудоемкой задачей (для этого требуется секвенирование многих последовательно перекрывающихся сегментов генома, ранее усиленных ПЦР). Следовательно, по сравнению с ORF5 или ORF7 доступно мало целых последовательностей генома.

Секвенирование следующего поколения

Несколько ограничений секвенирования Сэнгера можно преодолеть с помощью секвенирования следующего поколения (NGS), также известного как высокопроизводительное секвенирование. Термин используется для описания ряда различных современных технологий секвенирования, не основанных на Сэнгере. Эти технологии очень мощные и, безусловно, являются революцией в области геномики и молекулярной биологии, поскольку они позволяют нам секвенировать ДНК и РНК гораздо быстрее и чрезвычайно глубже, чем секвенирование Сэнгера.

Преимущества NGS:

• Легкость получения полногеномных последовательностей.
• Легкость определения наличия более одного штамма в образце.
• Легкость определения рекомбинационных событий.
• Полную характеристику роя мутации. Можно получить от ста до сотен тысяч последовательностей только из одного образца.

Ограничения NGS:

• Большие данные, полученные только из одного образца, могут быть трудно управляемыми.
• Высокие навыки в биоинформатике необходимы для оценки показаний последовательностей и минимизации неправильной интерпретации данных.
• Сложность определения, имеет ли последовательность, показанная низкочастотной мутации, биологическое значение.
• До сих пор, стоимость.