6 Secuenciación

Con respecto a las muestras de sangre individuales, es importante tener en cuenta que para secuenciar se necesitan muestras con valores de Ct por debajo de 32. Las muestras con valores de Ct> 32 son difíciles de secuenciar, ya que la cantidad de virus es insuficiente.

Los fluidos orales grupales y los pooles de sangre no deben usarse para secuenciar, ya que al mezclar diferentes animales estamos disminuyendo la cantidad de virus presente y además pueden contener fácilmente más de una cepa.

Mediante la secuenciación es posible:

1. Distinguir especies
2. Distinguir aislados de virus de campo de las vacunas
3. Obtener una valiosa información epidemiológica para determinar la fuente de la infección, cuántas cepas están presentes en un hato/granja/población/empresa/región, cuál es el más frecuente, los eventos de recombinación, etc.

En general, si se obtienen secuencias con cierta frecuencia (se recomienda secuenciar cada cepa involucrada en un brote o periódicamente, al menos cada seis meses), podemos llegar a determinar la fuente principal de infecciones y cómo circulan los aislados en un hato o en una región.

Eventualmente, podríamos usar esta información para establecer mejores medidas de control de la enfermedad.

Hoy en día, a través de la secuenciación no es posible:

1. (En general) predecir la virulencia de un aislamiento determinado;
2. Predecir el nivel de protección cruzada entre dos aislados, ya que los marcadores genéticos de virulencia y protección cruzada no se conocen con exactitud.

Para poder comparar el grado de similitud entre aislados y agruparlos según sus secuencias, se puede dibujar un árbol filogenético.

En general, para ilustrar las relaciones entre varios aislados los árboles son más útiles que la simple comparación de porcentajes de homología, ya que puede suceder que un grupo de cepas compartan un mismo porcentaje de similitud aun siendo diferentes.

En estos casos, los árboles son cruciales para observar las relaciones reales.

Árbol filogenético obtenido mediante el análisis de siete secuencias ORF5 de cuatro orígenes diferentes.

La barra representa una sustitución de 0,1 nucleótidos por sitio. La interpretación de este árbol es la siguiente: en la rama inferior hay un aislado no relacionado del origen 1 (O1) (O1- I3); su similitud con O1-I1 y O1-I2 del mismo origen, ubicados en la rama superior del árbol, es de 93,4% y 93,2%, respectivamente.

La similitud entre estos dos aislados relacionadas (O1-I1 y O1-I2) es del 97.5%. En el origen 2, hay dos aislados no relacionados: I4 e I5 (la similitud entre ellos es del 96,6%).

Probablemente, existe un vínculo entre los aislados O2-I4 y el origen 1 y entre O2-I5 y el origen 3. Finalmente, los aislados
I6 e I7 del origen 3 están estrechamente relacionados (> 99,8%; seguramente son la misma cepa).

Sin embargo, este punto de corte es completamente arbitrario. Para evitar interpretaciones erróneas, se debe tener en cuenta información adicional, tales como fechas y lugares de aislamiento, las relaciones epidemiológicas que se establecen entre las granjas y orígenes implicados.

Los eventos de recombinación deben considerarse cuando se calculan los árboles filogenéticos, ya que pueden desdibujar las verdaderas relaciones filogenéticas entre cepas.

Secuenciación Sanger

Hasta hace poco, la secuenciación de Sanger ha sido la principal herramienta para estudiar la diversidad genética. Sin embargo, esta técnica tiene varias limitaciones. Una de las más importantes es que solo podemos obtener la secuencia de consenso.

Como se ha dicho en repetidas ocasiones, el virus del PRRS existe en el hospedador como cuasiespecie. Por lo tanto, los mutantes de baja frecuencia se obvian cuando se usa Sanger.

Además, las secuencias obtenidas mediante la técnica de Sanger son muy difíciles de interpretar si en la muestra hay presentes dos o más cepas.

Aunque representa una proporción muy limitada del genoma total (4%), la ORF5 se usa generalmente para comparar cepas. Esto es así porque esta ORF tiene una alta tasa de mutación y los cambios son fáciles de observar.

Obviamente, la secuenciación del genoma completo proporcionaría mucha más información:

1. Agrupaciones filogenéticas y comparaciones entre cepas con mayor precisión
2. Identificación de posibles epítopos, marcadores epidemiológicos o de virulencia
3. Identificación de eventos de recombinación más allá de la ORF5.

Sin embargo, la secuenciación del genoma completo mediante Sanger es una tarea que requiere mucho tiempo, ya que precisa de la secuenciación de muchos segmentos de genoma superpuestos y consecutivos amplificados previamente por PCR.

En consecuencia, en comparación con ORF5 u ORF7, hay pocas secuencias de genoma completo disponibles.

Secuenciación masiva

Varias de las limitaciones que hemos discutido sobre secuenciación Sanger pueden superarse utilizando la secuenciación masiva o de próxima generación (NGS, por su acrónimo en inglés). El término se utiliza para describir una serie de diferentes tecnologías de secuenciación no basadas en Sanger.

Estas tecnologías tienen un enorme potencial y ciertamente son una revolución en el campo de la genómica y la biología molecular, ya que nos permiten secuenciar el ADN y el ARN mucho más rápido y de forma extremadamente más profunda que la secuenciación Sanger.

Ventajas de la NGS:

• Facilidad para obtener secuencias de genoma completo.
• Facilidad para determinar si hay más de una cepa en la muestra.
• Facilidad para identificar eventos de recombinación.
• Caracterización completa del espectro de mutantes (cuasiespecies). Es posible obtener de cientos a cientos de miles de secuencias a partir de una sola muestra.

Limitaciones de la NGS:

• La cantidad ingente de datos obtenidos de una sola muestra puede ser difícil de manejar.
• Se requiere elevada capacitación en bioinformática para evaluar las lecturas obtenidas y para minimizar la mala interpretación de los datos.
• Dificultad para discernir si una secuencia que muestra una mutación de baja frecuencia tiene un significado biológico.
• Hasta la fecha, el coste.