Иммуногистохимия (IHC) и на месте Гибридизация (ISH)

РПДР антиген вируса или нуклеиновая кислота может быть обнаружена в тканях путем IHC и ISHСвязь между обнаружением вирусов и поражениями может быть установлена комбинацией IHC или ISH и гистопатологии.

Изоляция и титрование вирусов

В то время как штаммы PRRSV2 могут быть выделены как в альвеолярных макрофагах свиней, так и в подлиниях африканской клеточной линии почек обезьян (CL-2621 и MARC-145), некоторые вирусы PRRSV1 и европейские вирусы могут быть выделены только в альвеолярных макрофагах свиней.

Поскольку цитопатические эффекты, которые возникают через 1-4 дня, не всегда ясны, выделение вируса обычно не является очевидным. Подтверждения должны быть получены RT-PCR, IPMA или IFA. (максимальная чувствительность на 7 день). Титрование вирусов можно проводить с помощью серийных разбавлений образца.

Обнаружение генома вируса PRRS

Ограничительный фрагмент длины полиморфизма (RFLP)

Он включает в себя переваривание ORF5 тремя рестрикционными ферментами. В результате генерируется трехзначный паттерн. Используется для дифференциации изолятовОднако было продемонстрировано, что различные изоляты могут иметь схожие паттерны RFLP. Поэтому секвенирование лучше, чем RFLP, для дифференциации изолятов.

Обычная цепная реакция обратной транскрипции-полимеразы (RT-PCR)

RT-PCR вместе с ELISA является наиболее часто выполняемым диагностическим тестом для PRRS. Он основан на обнаружении и амплификации конкретного сегмента генома..Он более чувствителен, чем вирусная изоляция, но поскольку обнаруживает геном, положительный результат РТ-ПЦР не подразумевает наличия жизнеспособного вируса. РТ-ПЦР обычно используется для усиления областей ORF5 и ORF7. Его чувствительность вариабельна, поскольку генетическое разнообразие вируса находится в непрерывном постоянно расширяющемся режиме; это явление требует постоянного обновления праймеров, используемых для минимизации присутствия ложноотрицательных результатов.

Он основан на обнаружении, амплификации и количественной оценке конкретного сегмента генома. Он обнаруживает и измеряет амплификацию целевого сегмента в течение каждого цикла ПЦР-реакции в режиме реального времени, а не в его конце, как в обычном RT-PCR. Коротко олигонуклеотиды, меченные флуоресцентным репортером, позволяют обнаруживать после гибридизации зонда с его комплементарной последовательностью. Реальный инструмент RT-PCR отвечает за измерение накопления флуоресцентного сигнала во время амплификации. Может быть выполнена относительная (полуквантификация) или абсолютная количественная оценка целевого сегмента. Когда требуется точная количественная оценка, обязательна стандартная линия из последовательных разбавлений того же штамма, который мы намерены обнаружить.

Реальный RT-PCR

Результаты RT-PCR обычно показываются как значения Ct. Значение Ct обратно количеству нуклеиновой кислоты, которая присутствует в образце..Это может быть точно (абсолютная количественная оценка) или приблизительно (полуквантификация) коррелирует с количеством копий в образце. Поэтому более низкие значения Ct указывают на высокие количества, в то время как более высокие значения Ct означают низкие количества целевой нуклеиновой кислоты. Для вирусных инфекций PRRS типичные значения Ct составляют около 26 циклов, при этом наиболее высокие значения Ct — около 26 — могут быть найдены у взрослых. В целом значения Ct ≥ 37 циклов рассматриваются как результаты с относительно низкой или нулевой биологической значимостью. Виремии из-за прививок ослабленным вирусом обычно варьируются от 30 до 35, в зависимости от штамма и возраста животного. Как происходит с обычным RT-PCR, в некоторых странах наблюдается отсутствие однородной производительности анализа RT-PCR. В настоящее время в коммерческих условиях RT-PCR анализы доступны в некоторых странах, но в некоторых лабораториях это домашний анализ. Как и обычный RT-PCR, может существовать переменное число ложных негативов; обычно в зависимости от стандартизации, улучшения и обновления анализа и от экспертизы лаборатории. Тем не менее, чувствительность аналогична или немного выше, чем у обычного RT