5 Detección del virus

Inmunohistoquímica (IHQ) e hibridación in situ (HIS).

El antígeno y el ácido nucleico del virus del PRRS pueden detectarse en tejidos mediante IHQ o HIS, respectivamente. La relación entre la presencia del virus y las lesiones puede establecerse mediante una combinación de IHQ o HIS e histopatología.

Aislamiento y titulación del virus

Mientras que las cepas de PRRSV2 pueden aislarse tanto en cultivos de macrófagos alveolares porcinos como en sublíneas de la línea celular de riñón de mono africano (CL-2621 y MARC-145), muchos de los virus PRRSV1 o parecidos a los europeos se pueden aislar únicamente en macrófagos alveolares porcinos.

Dado que los efectos citopáticos, que ocurren en 1-4 días, no siempre son claros, la replicación del virus en los cultivos celulares generalmente debe confirmarse mediante RT-PCR, IPMA o IF (sensibilidad máxima a los 7 días). La titulación del virus se puede hacer usando diluciones en serie de la muestra.

Detección del genoma del virus

Fragmentos de restricción de longitud polimórfica (Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP)

Implica la digestión de la ORF5 por tres enzimas de restricción. Como resultado, se genera un patrón de tres dígitos. Esta técnica se utiliza para diferenciar aislados. Sin embargo, se ha demostrado que diferentes aislados pueden compartir patrones de RFLP similares.

Por lo tanto, para diferenciar aislados la secuenciación (ver a continuación) es mejor que la técnica RFLP.

La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR)

RT-PCR, junto al ELISA, es la prueba diagnóstica más comúnmente utilizada para PRRS. Se basa en la detección y la amplificación de un segmento específico del genoma. Es más sensible que el aislamiento del virus, pero como detecta el genoma, un resultado positivo no implica necesariamente la presencia de virus viable.

La RT-PCR se usa generalmente para amplificar regiones de la ORF5 y de la ORF7. Su sensibilidad es variable debido a la diversidad genética del virus. Puesto que la diversidad aumenta de forma constante, se requiere una actualización continua de los cebadores utilizados con el objeto de minimizar los resultados falsos negativos.

Se basa en la detección, la amplificación y la cuantificación de un segmento específico del genoma. Detecta y mide la amplificación de un segmento concreto durante cada ciclo de una reacción de PCR a tiempo real, y no al final, como ocurre en la RT-PCR convencional.

De forma breve, los oligonucleótidos marcados con un indicador fluorescente permiten la detección después de la hibridación de la sonda con su secuencia complementaria.

Mediante el instrumento de RT-PCR en tiempo real, se realiza la medición de la acumulación de la señal fluorescente. Se puede realizar una cuantificación relativa (semi-cuantificación) o absoluta del segmento objetivo.

Para realizar una cuantificación exacta, se requiere crear una línea estándar a partir de diluciones en serie de la misma cepa que intentamos detectar.

Tiempo real RT-PCR

Los resultados RT-PCR a tiempo real generalmente se muestran como valores de Ct. El valor de Ct es inverso a la cantidad de ácido nucleico que está presente en la muestra.

Puede estar exactamente (cuantificación absoluta) o aproximadamente (semicuantificación) correlacionado con el número de copias del virus presente en la muestra. Por lo tanto, los valores más bajos de Ct indican cantidades altas, mientras que los valores más altos de Ct significan cantidades bajas de ácido nucleico. Para las infecciones por el virus del PRRS, los valores típicos de Ct están alrededor de 26 ciclos, con una variabilidad significativa dependiendo de la edad del animal; los valores de Ct alrededor de 17-18 ciclos se pueden encontrar en algunos lechones virémicos recién nacidos, mientras que los valores más altos de Ct (alrededor de 26) se pueden encontrar en adultos.

En general, los valores de Ct ≥ 37 ciclos se consideran resultados con una importancia biológica relativamente baja o nula.

Las viremias debidas a las vacunaciones con virus atenuados suelen oscilar entre 30 y 35, según la cepa y la edad del animal. Todos estos valores deben ser tomados únicamente como una mera aproximación.

En la actualidad, hay disponibles ensayos comerciales de RT-PCR a tiempo real, pero aun en algunos laboratorios es un ensayo home-made. En estos últimos casos pueden existir discrepancias en los resultados entre laboratorios, ya que difieren en el diseño de cebadores, sondas…

De manera similar a la RT-PCR convencional, podría existir un número variable de falsos negativos. Por lo general, depende de la estandarización, mejora y actualización del ensayo y de la experiencia del laboratorio.

De todas formas, la sensibilidad de la RT-PCR a tiempo real es similar o ligeramente superior a la de la RT-PCR convencional, pero nuevamente se basa en la idoneidad de los cebadores con la secuencia de la muestra problema. Obviamente, la RT-PCR a tiempo real puede diseñarse para distinguir entre especies.