Оптимизация стратегий пулирования образцов для мониторинга PRRSV

Введение

Одним из ключевых элементов контроля воздействия вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней является внедрение адекватной программы мониторинга^1,2,3,4. Пулирование сывороток поросят перед отъёмом — это метод, рекомендованный Американской ассоциацией ветеринарных врачей свиноводства (AASV) для мониторинга стада и классификации статуса по PRRSV¹, несмотря на то, что хорошо известно, что пулирование может снижать индивидуальную чувствительность теста ОТ-ПЦР².

Фернандо де Мерхелина и его коллеги^5,6 провели следующее исследование для оценки предела обнаружения ОТ-ПЦР при пулировании PRRSV-положительных сывороток. Они использовали сыворотки с разным уровнем виремии, измеренным по пороговому циклу (Ct), и смоделировали эффект разведения, чтобы определить оптимальную стратегию пулирования при сохранении хорошей чувствительности.

Материалы и методы

Всего было отобрано 47 положительных образцов сыворотки PRRSV-1 и 33 образца PRRSV-2, которые были распределены по четырём диапазонам значений Ct: 18-25, 25-30, 30-35 и 35-38 (образцы с Ct >38 считались отрицательными).

14 образцов PRRSV-1 были отнесены к группе Ct 18-25, 11 — к группе 25-30, 13 — к группе 30-35 и 9 — к группе 35-38. Для образцов PRRSV-2 по 9 образцов было отнесено к каждой из групп Ct (18-25, 25-30 и 30-35); образцы группы 35-38 не анализировались.

Рисунок 1. Протокол разведения, моделирующий объединение одной положительной сыворотки в пулы из 5, 10, 30, 60 и 120 сывороток.

Образцы подвергались последовательному разведению, моделирующему пулы из 5, 10, 30, 60 и 120 образцов (Рисунок 1). Чувствительность ОТ-ПЦР оценивалась для каждой группы Ct при каждом уровне разведения. Кроме того, была рассчитана линейная смешанная модель для оценки увеличения значений Ct при каждом уровне разведения.

Результаты

Результаты по чувствительности представлены в таблицах 1 и 2. Образцы с Ct<30 сохраняли 100% чувствительность практически во всех группах разведения и для обоих видов вируса. С другой стороны, у образцов с Ct>30 наблюдалось снижение чувствительности при увеличении размера пула как для PRRSV1, так и для PRRSV2.

Таблицы 1 и 2. Чувствительность (%) PRRSV-1 и PRRSV-2 по группам Ct ОТ-ПЦР и разведению, количество положительных образцов от общего числа в группе и 95% доверительный интервал. Цветовая кодировка: зелёный — чувствительность >90%, жёлтый — 60-90%, оранжевый — 30-60, красный — <30%.

Были рассчитаны уравнения линейной смешанной модели для каждого вида PRRSV, рассматривая образец как случайный эффект (Рисунки 2 и 3).

Рисунки 2 и 3. Значения Ct ОТ-ПЦР исходных и объединённых образцов сыворотки при различных разведениях, выраженных как Log10. Подобранная линейная смешанная модель для результатов PRRSV-1 и PRRSV-2.

Обсуждение

Результаты данного исследования подтверждают, что чувствительность объединённых образцов зависит от вирусной нагрузки положительных образцов. Учитывая новые сценарии с высокопатогенными штаммами в некоторых странах/регионах, где инфекция PRRSV приводит к высокой вирусной нагрузке в сыворотке, пулирование может быть обоснованной стратегией для снижения затрат при сохранении возможности раннего выявления заболевания.

Результаты по чувствительности также подтверждают, что для обоих видов PRRSV объединение как минимум 5 сывороток не оказывает влияния на чувствительность (при значениях Ct сыворотки < 30) или оказывает умеренное влияние (при значениях Ct > 30). Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями^2,3,4.

Согласно результатам авторов^5,6, максимальное возможное количество разведений до того, как образец будет считаться отрицательным (порог Ct >38), в основном зависит от вирусной нагрузки положительного образца (или образцов). Таким образом, рассматривая наихудший сценарий, при котором имеется только один положительный образец с низким Ct (35), максимально допустимое разведение для PRRSV-1 и PRRSV-2 составит 1:8 и 1:6 соответственно.

Пулирование сывороток — широко используемый метод мониторинга, поскольку увеличенный размер выборки позволяет контролировать больше животных при сниженных затратах. Например, в случае мониторинга станций хряков, где стандарт надзора чрезвычайно высок из-за необходимости обеспечивать PRRSV-отрицательный статус центров, расчётная стоимость индивидуального тестирования на PRRSV составляет около 5,19% от общей стоимости дозы спермы, при условии примерно 25-30 евро за индивидуальный тест сыворотки хряка⁷. Таким образом, это становится третьей по значимости статьёй затрат после постоянных расходов (зарплаты сотрудников, энергия, помещения и т. д.) и переменных расходов (корм, медикаменты и опилки). При внедрении пулирования затраты могут снизиться с 5,19% до всего 0,17% при применении максимально агрессивной стратегии пулирования (120 образцов на пул), либо до 1,04% при использовании более осторожного пула из 5 образцов, направленного на сохранение наилучшего баланса между стоимостью и чувствительностью.

Заключение

Понимание эпидемиологии PRRSV, в частности распространённости и виремии животных, а также влияния пулирования сывороток на чувствительность ОТ-ПЦР PRRSV, является ключевым для внедрения надёжной и при этом экономичной стратегии мониторинга. Результаты данного исследования показывают, что для обоих видов PRRSV наиболее сбалансированной стратегией является объединение от 5 до 10 сывороток, поскольку такой подход существенно не снижает чувствительность теста, при этом позволяя заметно сократить затраты на мониторинг.

Ссылки

1- Holtkamp, D., et al. (2021). Proposed modifications to Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus herd classification. Journal of Swine Health and Production, 29(5), 261-270.
2- Rovira A., et. al. (2007). Evaluation of the sensitivity of reverse-transcription polymerase chain reaction to detect porcine reproductive and respiratory syndrome virus on individual and pooled samples from boars. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,19(5), 502-509.
3- Lebret, A., et. al. (2023). Alternative samples for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome surveillance in an endemic PRRSV-1-infected breeding herd: A descriptive study. Veterinary Sciences, 10(9), 55.
4- Vilalta, C., et. al. (2019). Effect of litter aggregation and pooling on detection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus in piglet processing fluids. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 31(4), 625-628.
5- de Mergelina, F., et. al. (2025). Serum pooling: Making PRRSV surveillance in the boar stud affordable. 10.5281/zenodo.16077426.
6- de Mergelina, F., et. al. (2025). Optimizing Pooling Strategies for PRRSV Surveillance: RT-PCR Detection Limits for PRRSV1 and PRRSV2. 10.13140/RG.2.2.12868.49288.
7- Luongo, C., et. al. (2022). Should all fractions of the boar ejaculate be prepared for insemination rather than using the sperm-rich only? Biology, 11(2), 210. 10.3390/biology11020210

PRRSControl