Ottimizzazione delle strategie di campinamento in pool per il monitoraggio del PRRSV
Introduzione
Una delle chiavi per controllare l’impatto del virus della sindrome riproduttiva e respiratoria del suino è l’implementazione di un adeguato programma di monitoraggio1,2,3,4. Il raggruppamento in pool dei sieri dei suinetti prossimi allo svezzamento è il metodo raccomandato dall’American Association of Swine Veterinarians (AASV) per il monitoraggio degli allevamenti da riproduzione e la classificazione dello stato PRRSV1, sebbene sia ben noto che questa metodica possa ridurre la sensibilità individuale del test RT-PCR2.
Fernando de Mergelina e colleghi5,6 hanno condotto il seguente studio per valutare il limite di rilevazione della RT-PCR quando si esegue il campionamento in pool di sieri positivi al PRRSV. Hanno utilizzato sieri con diversi livelli di viremia, misurati mediante il Cycle threshold (Ct), e hanno simulato un effetto di diluizione per determinare la migliore strategia di pool mantenendo una buona sensibilità.
Materiali e metodi
Un totale di 47 campioni di siero positivi per PPRSV-1 e 33 per PRRSV-2 è stato classificato in quattro gruppi di intervallo Ct: 18-25, 25-30, 30-35 e 35-38 (i campioni con Ct >38 sono stati considerati negativi).
Quattordici campioni di PRRSV-1 sono stati classificati nel gruppo Ct 18-25, 11 nel gruppo 25-30, 13 nel gruppo 30-35 e 9 nel gruppo 35-38. Per i campioni di PRRSV-2, 9 sono stati classificati in ciascuno dei gruppi Ct (18-25, 25-30 e 30-35); non sono stati analizzati campioni appartenenti al gruppo Ct 35-38.
Figura 1. Protocollo di diluizione che simula il raggruppamento in pool di un siero positivo in pool di 5, 10, 30, 60 e 120 sieri.
I campioni sono stati diluiti in serie simulando pool di 5, 10, 30, 60 e 120 campioni (Figura 1). La sensibilità della RT-PCR è stata stimata per ciascun gruppo Ct a ogni livello di diluizione. Inoltre, è stato calcolato un modello lineare misto per stimare l’incremento dei valori Ct a ciascun livello di diluizione.
Risultati
I risultati di sensibilità sono riportati nelle tabelle 1 e 2. I campioni con Ct<30 hanno mantenuto una sensibilità del 100% in quasi tutti i gruppi di diluizione in entrambe le specie virali. Al contrario, i campioni con Ct>30 hanno mostrato una riduzione della sensibilità con l’aumentare della dimensione del pool sia in PRRSV1 sia in PRRSV2.
Tabelle 1 e 2. Sensibilità (%) di PRRSV-1 e PRRSV-2 per gruppo Ct della RT-PCR e diluizione, numero di campioni positivi sul totale per gruppo e intervallo di confidenza al 95%. Codice colori: verde per sensibilità >90%, giallo per 60-90%, arancione per 30-60 e rosso per <30%.
Le equazioni del modello lineare misto per ciascuna specie di PRRSV sono state calcolate considerando il campione come effetto casuale (Figure 2 e 3).
Figure 2 e 3. Valori Ct della RT-PCR dei campioni di siero iniziali e pool, con diverse diluizioni espresse come Log10. Modello lineare misto adattato ai risultati di PRRSV-1 e PRRSV-2.
Discussione
I risultati di questo studio confermano che la sensibilità dei campioni in pool dipende dalla carica virale dei campioni positivi. Considerando gli scenari con nuovi ceppi altamente patogeni in alcuni paesi o regioni, in cui l’infezione da PRRSV determina un’elevata carica virale nel siero, il pool può essere una strategia valida per ridurre i costi e rilevare comunque l’insorgenza precoce della malattia.
I risultati di sensibilità confermano inoltre che, per entrambe le specie di PRRSV, il pool di almeno 5 sieri non ha effetto sulla sensibilità (se i valori Ct del siero sono < 30), oppure ha un effetto moderato (se i valori Ct del siero sono > 30). Questi risultati sono coerenti con studi precedenti2,3,4.
Sulla base dei risultati degli autori5,6, il numero massimo di diluizioni possibili prima di considerare un campione negativo (soglia Ct >38) dipende principalmente dalla carica virale del campione o dei campioni positivi. Pertanto, considerando lo scenario peggiore definito come un solo campione positivo con un Ct basso (35), la diluizione massima consentita per PRRSV-1 e PRRSV-2 sarebbe rispettivamente di 1:8 e 1:6.
Il pool del siero è una tecnica di monitoraggio ampiamente utilizzata, poiché campioni di dimensioni maggiori consentono di monitorare più animali a costi ridotti. Per esempio, nel caso del monitoraggio dei centri verri, dove lo standard di sorveglianza è estremamente elevato per la necessità di garantire che i centri rimangano PRRSV-negativi, il costo stimato del test individuale di sorveglianza PRRSV è vicino al 5.19% del costo totale di una dose seminale, ipotizzando circa 25-30 euro per ciascun test individuale sul siero del verro7. Di conseguenza, diventa il terzo costo più significativo dopo i costi fissi (stipendi dei lavoratori, energia, strutture, ecc.) e i costi variabili (mangime, farmaci e segatura). Se si implementasse il monitoraggio in pool, i costi si ridurrebbero dal 5.19% ad appena lo 0.17% applicando una strategia molto aggressiva (120 campioni per pool), oppure all’1.04% utilizzando un pool più prudente di 5 campioni che mira a mantenere il miglior equilibrio tra costo e sensibilità.
Conclusione
Comprendere l’epidemiologia del PRRSV, in particolare la prevalenza e la viremia degli animali, nonché l’effetto del campionamento in pool del siero sulla sensibilità della RT-PCR per PRRSV, è fondamentale per implementare una strategia di monitoraggio adeguata che sia affidabile e riduca i costi. I risultati di questo studio indicano che, per entrambe le specie di PRRSV, la strategia più equilibrata è un pool di 5-10 sieri, poiché questo approccio non compromette in modo significativo la sensibilità del test pur consentendo una notevole riduzione dei costi di monitoraggio.
Riferimenti bibliografici
1- Holtkamp, D., et al. (2021). Proposed modifications to Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus herd classification. Journal of Swine Health and Production, 29(5), 261-270.
2- Rovira A., et. al. (2007). Evaluation of the sensitivity of reverse-transcription polymerase chain reaction to detect porcine reproductive and respiratory syndrome virus on individual and pooled samples from boars. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,19(5), 502-509.
3- Lebret, A., et. al. (2023). Alternative samples for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome surveillance in an endemic PRRSV-1-infected breeding herd: A descriptive study. Veterinary Sciences, 10(9), 55.
4- Vilalta, C., et. al. (2019). Effect of litter aggregation and pooling on detection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus in piglet processing fluids. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 31(4), 625-628.
5- de Mergelina, F., et. al. (2025). Serum pooling: Making PRRSV surveillance in the boar stud affordable. 10.5281/zenodo.16077426.
6- de Mergelina, F., et. al. (2025). Optimizing Pooling Strategies for PRRSV Surveillance: RT-PCR Detection Limits for PRRSV1 and PRRSV2. 10.13140/RG.2.2.12868.49288.
7- Luongo, C., et. al. (2022). Should all fractions of the boar ejaculate be prepared for insemination rather than using the sperm-rich only? Biology, 11(2), 210. 10.3390/biology11020210
