Optimización de las estrategias de pooling para la vigilancia del PRRSV
Introducción
Una de las claves para controlar el impacto del virus del PRRS es implementar un programa de monitorización adecuado1,2,3,4. El pooling de sueros de lechones no destetados es el método recomendado por la American Association of Swine Veterinarians (AASV) para la monitorización y clasificación de las granjas de reproductoras. Aun así, es bien sabido que el pooling puede reducir la sensibilidad individual de la prueba RT-PCR2.
Fernando de Mergelina y colaboradores5,6 realizaron el siguiente estudio para evaluar el límite de detección de la RT-PCR al hacer pools de sueros positivos a PRRSV. Utilizaron sueros con distintos niveles de viremia, medidos mediante el Cycle Threshold (Ct), y simularon un efecto de dilución para determinar la mejor estrategia de pooling que mantuviera una buena sensibilidad.
Material y métodos
Se clasificaron una serie de muestras de suero positivas (47 para PPRSV-1 y 33 para PRRSV-2) en cuatro grupos de intervalo de Ct: 18-25, 25-30, 30-35 y 35-38 (las muestras con Ct >38 se consideraron negativas).
14 muestras de PRRSV-1 se categorizaron en el grupo de Ct 18-25, 11 en el grupo 25-30, 13 en el grupo 30-35 y 9 en el grupo 35-38. En el caso de las muestras de PRRSV-2, 9 se clasificaron en cada uno de los grupos de Ct (18-25, 25-30 y 30-35) y no se analizaron muestras pertenecientes al grupo de Ct 35-38.
Figura 1. Protocolo de dilución que simula la mezcla de un suero positivo dentro de pools de 5, 10, 30, 60 y 120 sueros.
Las muestras se diluyeron en serie simulando pools de 5, 10, 30, 60 y 120 muestras (Figura 1). Se estimó la sensibilidad de la RT-PCR para cada grupo de Ct en cada intervalo de dilución. Además, se calculó un modelo lineal mixto para estimar el incremento de los valores de Ct en cada intervalo de dilución.
Resultados
Los resultados de sensibilidad se representan en las tablas 1 y 2. Las muestras con Ct<30 mantuvieron una sensibilidad del 100% en casi todas las diluciones y en ambas especies víricas. Por otro lado, las muestras con Ct>30 mostraron una disminución de la sensibilidad a medida que aumentaba el tamaño del pool, tanto en PRRSV1 como en PRRSV2.
Tablas 1 y 2. Sensibilidad (%) de PRRSV-1 y PRRSV-2 por grupo de Ct (RT-PCR) y dilución, número de muestras positivas sobre el total por grupo, e intervalo de confianza del 95%. Código de color: verde para sensibilidad >90%, amarillo para 60-90%, naranja para 30-60 y rojo para <30%.
Se calcularon las ecuaciones del modelo lineal mixto para cada especie de PRRSV, considerando la muestra como efecto aleatorio (Figuras 2 y 3).
Figuras 2 y 3. Valores de Ct de la RT-PCR de muestras de suero iniciales y en pool, con distintas diluciones expresadas como Log10. Modelo lineal mixto ajustado para los resultados de PRRSV-1 y PRRSV-2.
Discusión
Los resultados de este estudio corroboran que la sensibilidad de los pools depende de la carga viral de las muestras positivas. Considerando los escenarios de nuevas cepas altamente patógenas en algunos países o regiones, en los que la infección por PRRSV da lugar a una elevada carga viral en suero, el pooling puede ser una estrategia válida para reducir costes y seguir detectando el inicio precoz de la enfermedad.
Los resultados de sensibilidad también confirman que, para ambas especies de PRRSV, el pooling de al menos 5 sueros no tiene efecto sobre la sensibilidad (si los valores de Ct del suero son < 30), o bien tiene un efecto moderado (si Ct del suero > 30). Estos resultados son consistentes con estudios previos2,3,4.
Basándose en los resultados de los autores5,6, el número máximo de diluciones posibles antes de considerar una muestra como negativa (umbral de Ct >38) depende principalmente de la carga viral de la muestra o muestras positivas. Así, considerando el peor escenario posible definido como una única muestra positiva con un Ct bajo (35), la dilución máxima admisible para PRRSV-1 y PRRSV-2 sería de 1:8 y 1:6, respectivamente.
El pooling de sueros es una técnica de monitorización ampliamente utilizada, ya que permite monitorizar más animales con costes reducidos. Por ejemplo, en el caso de la monitorización de centros de verracos, donde el estándar de vigilancia es extremadamente alto debido a la necesidad de garantizar que los centros permanezcan PRRSV-negativos, el coste estimado del test individual de PRRSV es cercano al 5.19% del coste total de una dosis seminal, asumiendo alrededor de 25-30 euros por prueba individual de suero de verraco7. Por tanto, pasa a ser el tercer coste más significativo tras los costes fijos (salarios de los trabajadores, energía, instalaciones…) y los costes variables (pienso, medicación…). Si se implantara el pooling, los costes se reducirían del 5.19% a solo un 0.17% al aplicar una estrategia de pooling muy agresiva (120 muestras por pool), o al 1.04% al utilizar un pool más prudente de 5 muestras que busca mantener el mejor equilibrio entre coste y sensibilidad.
Conclusión
Comprender la epidemiología del virus del PRRS, especialmente la prevalencia y la viremia de los animales, así como el efecto del pooling de sueros sobre la sensibilidad de la RT-PCR, es clave para implantar una estrategia de monitorización que sea fiable y reduzca costes. Los resultados de este estudio indican que, para ambas especies de PRRSV, la estrategia más equilibrada es el pooling de entre 5 y 10 sueros, ya que este enfoque no compromete de forma significativa la sensibilidad de la prueba y aun así permite reducir notablemente los costes de monitorización.
Referencias
1- Holtkamp, D., et al. (2021). Proposed modifications to Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus herd classification. Journal of Swine Health and Production, 29(5), 261-270.
2- Rovira A., et. al. (2007). Evaluation of the sensitivity of reverse-transcription polymerase chain reaction to detect porcine reproductive and respiratory syndrome virus on individual and pooled samples from boars. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,19(5), 502-509.
3- Lebret, A., et. al. (2023). Alternative samples for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome surveillance in an endemic PRRSV-1-infected breeding herd: A descriptive study. Veterinary Sciences, 10(9), 55.
4- Vilalta, C., et. al. (2019). Effect of litter aggregation and pooling on detection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus in piglet processing fluids. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 31(4), 625-628.
5- de Mergelina, F., et. al. (2025). Serum pooling: Making PRRSV surveillance in the boar stud affordable. 10.5281/zenodo.16077426.
6- de Mergelina, F., et. al. (2025). Optimizing Pooling Strategies for PRRSV Surveillance: RT-PCR Detection Limits for PRRSV1 and PRRSV2. 10.13140/RG.2.2.12868.49288.
7- Luongo, C., et. al. (2022). Should all fractions of the boar ejaculate be prepared for insemination rather than using the sperm-rich only? Biology, 11(2), 210. 10.3390/biology11020210
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