3 Métodos alternativos de muestreo y conservación

Fluidos orales

En algunos países, el fluido oral se ha convertido en una muestra muy utilizada para detectar el genoma del virus del PRRS por RT-PCR y los anticuerpos por ELISA.

Hay ensayos comerciales y home-made para ambas técnicas. No obstante, es importante destacar que, debido a las características físicas del fluido oral, los ensayos de RT-PCR y ELISA utilizados para el análisis de suero no pueden utilizarse directamente, sino que deben adaptarse.

En comparación con la extracción de sangre, las principales ventajas del uso de fluido oral en animales son:

• El comportamiento natural de los cerdos facilita el muestreo.
• No es invasivo. Gran reducción del estrés.
• Mayor seguridad para los operarios.
• Reducción en mano de obra/tiempo.
• Posibilidad de evaluar un gran número de individuos en muestras agregadas (útiles para monitorizar).

Con respecto a la RT-PCR, el suero y el fluido oral podrían considerarse equivalentes durante el período de viremia. Durante las dos primeras semanas, la cantidad de virus en suero es igual o superior, mientras que a partir de las tres o cuatro semanas es mayor en el fluido oral.

Por tanto, los cerdos podrían mostrar resultados RT-PCR negativos para el suero y positivos para el fluido oral. Durante este período, la detección del virus en el fluido oral suele ser intermitente.

Otro punto importante a tener en cuenta es que el período de excreción en cerdos infectados previamente vacunados es menor y mucho más intermitente. Obviamente, este hecho tiene implicaciones directas en el uso de fluidos orales en una granja endémica donde se haya vacunado los animales a muestrear.

Los ELISAs para sueros podrían considerarse específicos con un grado variable de sensibilidad. En el caso de los fluidos orales, parece que los ELISAs sí podrían tener un problema de especificidad, detectándose un 5-7% de falsos positivos.

Las condiciones durante la recolección, envío, almacenamiento, etc. del fluido oral pueden influir en la eficiencia del diagnóstico laboratorial:

• Número de cuerdas (distribución, tamaño y densidad de los corrales).
• Material de las cuerdas. Se recomienda algodón sin tratar.
• Los animales enfermos interactúan menos, o incluso no interactúan con la cuerda.
• Edad de los animales. Difícil muestrear animales jóvenes (3-5 semanas de edad), ya que interactúan poco con la cuerda.
• Contaminación por restos de pienso o heces.
• Condiciones de almacenamiento y envío. Es importante tener en cuenta que el ARN se degrada fácilmente en los fluidos biológicos. Por lo tanto, las condiciones de envío y almacenamiento son críticas.
• Métodos de extracción del ARN.

Cordón umbilical

Cuando es necesario muestrear lechones recién nacidos, por ejemplo para determinar si existe transmisión vertical, aparecen varios problemas: obtener fluido oral es muy complicado, y respecto a la muestra de sangre esta es a menudo insuficiente o de mala calidad (coagulada).

Además, tomar sangre de animales pequeños es una tarea que requiere mucho tiempo y en algunos casos se provoca la muerte del lechón. Una alternativa en el muestreo de lechones recién nacidos es recolectar el cordón umbilical fresco.

Ventajas del cordón umbilical para determinar la transmisión vertical:

• Muy fácil de recoger. Puede ser realizado directamente por los trabajadores de la granja. El cordón umbilical debe ligarse y cortarse (se recomiendan porciones de ≥ 5 cm).
• Se puede congelar.
• El muestreo no consume mucho tiempo.
• La sensibilidad es tan alta como el sangrado.

Como puede existir contaminación cruzada, el cordón umbilical se debe usar para determinar el estado de la camada más que determinar la prevalencia del individuo.

Sangre seca en papel de filtro (Absorbente)

A menudo, las condiciones de almacenamiento de las muestras en el campo no son óptimas, especialmente cuando se quieren analizar patógenos ARN. Para prevenir la degradación del ARN, las muestras deben refrigerarse o congelarse.

El papel absorbente usado para almacenar sangre seca son filtros tratados que contienen sustancias químicas que lisan las células, desnaturalizan las proteínas y protegen el ADN y el ARN de las nucleasas, la oxidación y el daño de la luz UV.

Se pueden usar para recolectar, transportar y almacenar hasta 125 μL de sangre, fluido oral o cualquier otro fluido de interés a temperatura ambiente.

Por lo tanto, una de las principales ventajas de este método es que las muestras pueden enviarse al laboratorio por correo postal ordinario. Las muestras pueden almacenarse durante largos períodos, de meses a años, ya que los ácidos nucleicos se inmovilizan y se conservan en las fibras de la matriz.

Si comparamos la sensibilidad y la especificidad de la RT-PCR a tiempo real para la detección del virus del PRRS, directamente en muestras frescas o en muestras incorporadas en papel absorbente, existen problemas en la detección del virus en fluido oral incorporado en el papel.

Respecto a la sangre incorporada al papel, la sensibilidad también podría debido a la poca cantidad de muestra recolectada, y especialmente en aquellas muestras con poca cantidad de virus.

Por lo tanto, las muestras frescas con valores Ct cercanos al corte (alto Ct, es decir, poca cantidad de virus) podrían resultar negativas cuando se transfieren al papel absorbente. En definitiva, parece que el método podría perder sensibilidad en los animales infectados que ya no están cursando la forma más aguda.